< PreviousAnalisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 275BAB XIV ANALISIS MIKROBIOLOGIS Hampir di semua tempat dapat dijumpai mikroba, baik di udara , air, tanah maupun permukaan meja atau peralatan. Semuanya dapat berperan sebagai sumber kontaminasi eksternal bahan dan produk pangan. Di alam, populasi mikroba tidak memisahkan diri tetapi berada dalam campuran dengan berba-gai sel lainnya. Di laboratorium, populasi mikroba ini dapat dipi-sahkan menjadi kultur murni. Kultur ini mengandung hanya satu jenis organisme dan cocok untuk mempelajari sifat morfo-logis dan biokimianya. Gambar 14.1. Berbagai jenis mikroba yang diambil dari kulit ikan 14.1 Teknik kerja aseptis Kemampuan teknik seseorang bekerja secara aseptik selama pengambilan sampel maupun pe-ngujian mikrobiologis di lapangan dan di laboratorium sangat untuk menjaga integritas sampel berikut sumbernya serta memperolah data hasil uji mikrobiologis yang akurat. Peralatan laboratorium yang di-perlukan untuk bekerja secara aseptik antara lain : 1. Wadah yang steril untuk digu-nakan sebagai tempat pe-nyimpanan contoh 2. Perlengkapan sebagai pendu-kung agar tercapai kondisi steril seperti bunsen, pisau steril, wadah pengangkut ber-pendingin, refrigerator, free-zer, es kering, tabung nitro-gen cair, anaerobic jar, inku-bator, penangas air, autoclaf, laminar flow, biohazard cabi-nets. 3. Peralatan untuk pemindahan sampel / media atau kultur cair antara lain medium cair steril, media padat steril siap pakai, media untuk kultur jaringan maupun media untuk sistem kultur kontinu. Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 27614.2 Menyiapkan peralatan dan media kultur mikroba Tidak ada media tunggal yang hanya ditumbuhi oleh satu jenis mikroba. Setiap media dapat ditumbuhi oleh beberapa jenis mikroba. Makin spesifik suatu media, maka semakin sedikit jenis mikroba yang dapat tumbuh pada media tersebut, dengan demikian makin baik media tersebut untuk menetapkan jenis mikroba kontaminan. Namun karena tidak ada satu jenis media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu jenis mikroba, maka perlu menggunakan kombinasi bebe-rapa media. Bila menggunakan media seperti dianjurkan oleh Farmakope, pada umumnya sudah cukup untuk menetapkan jenis mikroba kontaminan patogen yang dipersyaratkan. Bila menggunakan beberapa media secara bersama dapat menimbulkan permasalahan, ka-rena jika kontaminan lebih dari satu jenis maka koloni pada media yang berbeda mungkin dari jenis berbeda. Dengan demikian media satu tidak mem-perkuat kesimpulan dari media yang lain. Disamping itu, peng-gunaan beberapa media secara bersama dapat menjadi pem-borosan. Untuk mengantisipasi hal ini da-pat dilakukan satu media pada tahap pertama dan dilanjutkan dengan media lain jika hasilnya meragukan. Akan tetapi yang menjadi pertanyaan adalah me-dia yang mana harus digunakan lebih dahulu. Untuk menentukan media yang dipergunakan maka diperlukan analisa mengenai sifat mikroba yang diuji dan media yang digunakan (Tabel 14.1). Komponen yang terkandung pada media dan reaksi/respon yang terjadi bila suatu jenis mikroba tumbuh merupakan pe-ngetahuan yang sangat diper-lukan. Dari pengetahuan tersebut maka urutan media yang diguna-kan akan lebih mudah ditentukan dan hasilnya akan saling mem--perkuat untuk menetapkan jenis kontaminan tersebut. Namun dengan cara demikian walaupun dapat menghemat penggunaan media dan jenis kontaminan dapat ditetapkan dengan yang lebih baik tetapi memerlukan waktu pengujian lebih lama. 14.2.1 Penyiapan peralatan Peralatan utama yang perlu dipersiapkan dalam analisis bio-logis adalah tabung uji dan ca-wan petri, ose (loop ) dan jarum (needle), pipet, ruang kultur, sha-king waterbath, dan refrigerator. Tabung uji dan cawan petri digu-nakan untuk mengkultur mikroba. Tabung uji terbuat dari kaca, se-dangkan cawan petri terbuat dari kaca atau plastik. Media tumbuh yang ditambahkan ke tabung uji dapat berupa media kaldu atau agar, sedangkan pada Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 277cawan petri hanya berbentuk agar (Tabel 14.1). Kondisi steril dalam tabung kultur dipertahankan dengan berbagai tipe penutup. Tipe penutup yang pertama adalah cotton plug (Gambar 14.2.) yang dikembang-kan oleh Schroeder dan von Dusch di abad ke-19. Pada saat ini banyak digunakan sleevelike cup yang terbuat dari logam atau plastik tahan panas (Gambar 14.3). Tabel 14.1. Mikroba, media, dan karakteristik Mikroba Media Karakteristik Staphylococcus aureus Mannitol salt agar (MSA) Kuning dengan zona kuning Vogel Johnson Agar (VGA) Hitam dikelilingi zona kuning Baird Parker Agar (BPA) Hitam berkilau di kelilingi zona jernih Pseudomonas aeruginosa Cetrimide Agar Medium (CAM) Kehijauan Pseudomonas Agar Medium- deteksi fluoresin (PAM-p) Kekuningan Salmonella sp. Bismuth Sulfite Agar (BSA) Hitam atau hijau riliant Green Agar (BGA) Hitam atau hijau Kecil, transparan, tidak berwarna atau merah muda hingga buram, dikelilingi zona merah muda Xylose-Lysine-Desoxycho- late Agar Medium (XLD) Merah, dengan atau tanpa pusat berwarna hitam Eschericia coli Eosin Methylene Blue (L. EMB) Koloni hitam dengan kilap logam MacConkey Agar (MCA) Merah bata, dikelilingi endapan empedu Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 278Cawan petri memiliki permukaan yang relatif labih luas untuk per-tumbuhan dan pengembangan mikroba dibandingkan dengan ta-bung uji. Cawan petri terdiri dari dua bagian. Bagian bawah ca-wan yang mengandung medium dan bagian atas cawan yang berfungsi sebagai penutup. Ca-wan petri dibuat dengan berbagai ukuran, sesuai kebutuhan pene-litian. Umumnya digunakan cawan petri dengan diameter 15 cm. Media agar cair steril dari agar deep tube sebanyak 15-20 ml ditu-angkan ke cawan yang telah disterilkan sebelumnya. Dapat juga medium cair steril yang dibuat dalam labu 250 atau 500 ml. Bila didinginkan hingga suhu 40 oC, medium tersebut akan membeku. Gambar 14.2. Cotton plog Gambar 14.3. Sleevelike cup Sumber : Cappuccino, 1987 Pada saat inkubasi, cawan petri harus disimpan dalam inkubator dengan posisi terbalik. Bagian tutupnya terletak di bagian ba-wah. Posisi demikian bertujuan untuk mencegah pengembunan pada permukaan tutup selama pembekuan media agar menetes ke permukaan media agar. Mikroba perlu dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya, atau dari stock culture ke ber-bagai media untuk dipelihara atau dipelajari. Pemindahan tersebut disebut subculturing dan harus dilakukan dalam kondisi lingku-ngan steril untuk mencegah ke-mungkinan terjadinya kontamina-si. Pemindahan mikroba dapat dila-kukan dengan menggunakan ka-wat ose dan jarum (Gambar 14.4.). Keduanya terbuat dari ni-Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 279kel atau platina dan dimasuk-kan ke dalam logam yang berfungsi sebagai pegangan. Keduanya merupakan peralatan yang tahan dan mudah disterilisasi dengan membakarnya dalam bagian api yang biru dari api pembakaran Bunsen. Gambar 14.4. Pemindahan mikroba menggunakan ose Sumber : Cappuccino, 1987 Pemindahan mikroba secara ste-ril juga dapat dilakukan dengan menggunakan pipet. Pipet dapat berperan sebagai sedotan yang mengangkat cairan. Alat ini ter-buat dari kaca atau plastik. Pipet dapat disterilisasi dengan cara memasukkan semuanya ke ka-nister atau masing-masing di-bungkus kertas coklat dan disteri-lisasi dalam otoklaf (autoclave) atau oven pengering panas. Mikroba yang telah dipindahkan perlu ditumbuhkan. Agar tumbuh baik, diperlukan ruangan kultur yang mampu mempertahankan kondisi suhu. Kebutuhan utama dalam kultur mikroba adalah me-ngupayakan mereka dapat tum-buh dalam temperatur optimum. Inkubator dapat digunakan untuk mempertahankan suhu optimum selama periode pertumbuhan mi-kroba. Inkubator mempunyai prinsip kerja seperti oven, dimana pengontrolan suhu dilakukan de-ngan menggunakan termostate. Dengan demikian, suhu dapat diubah sesuai kebutuhan mikroba yang spesifik. Sebagian besar inkubator meng-gunakan panas kering. Uap air disuplai dengan meletakkan ge-las Beaker berisi air dalam inku-bator selama periode pertumbu-han. Kondisi lembab mencegah terjadinya dehidrasi dari medium dan deangan demikian menghin-dari terjadinya kesalahan hasil penelitian. Shaking waterbath adalah alat yang digunakan untuk mengkultur mikroba. Alat ini dapat mema-naskan dan menggoyangkan. Keuntungan penggunaan alat ini adalah mempermudah dan me-Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 280nyeragamkan penyebaran panas ke wadah kultur. Gerakan meng-goyang (agitation) dapat mem-bantu meningkatkan proses aera-si sehingga mempercepat per-tumbuhan mikroba. Kerugian alat ini hanya dapat digunakan untuk mengkultur mikroba dalam satu medium kaldu. Refrigerator memiliki beragam fungsi dalam bidang biologi, diantaranya berperan memelihara dan menyimpan kultur stok dian-tara dua periode penanaman, menyimpan media steril untuk mencegah dehidrasi, dan berpe-ran sebagai gudang bagi larutan yang tidak tahan panas, antibio-tik, serum, dan reagen biokimia-wi. 14.2.2 Penyiapan media Untuk tumbuh dan berkembang, mikroba membutuhkan suplai nu-trisi yang memadai dan lingkung-an pertumbuhan yang sesuai. Di laboratorium, suplai nutrisi diberi-kan dalam bentuk media kultur yang mengandung senyawa se-derhana. Media kultur dapat berbentuk ca-ir, semi padat, dan padat. Media kultur berwujud cair tidak me-ngandung agar sebagai pengen-tal dan biasa disebut medium kal-du (broth medium). Penambahan agar menjadikan medium berben-tuk semi padat dan padat. Agar merupakan ekstrak rumput laut, yaitu karbohidrat yang dido-minasi oleh galaktosa dan tidak mengandung nutrisi. Media pa-dat telah membutuhkan 1.5-1.8 % agar, sedangkan media semi pa-dat membutuhkan < 1% agar. Agar berperan sebagai agen pe-ngental yang baik. Agar mencair pada suhu 100oC dan mengental pada suhu 40 oC. Karena sifat ini, organisme dapat dikultur pada suhu 37.5 oC atau sedikit lebih tinggi tanpa khawatir mediumnya mencair. Media padat dapat disimpan dalam tabung reaksi, yang diikuti dengan pendinginan dan penge-rasan sehingga membentuk agar miring (agar slants) (Gambar 14.5.). Media ini digunakan untuk memelihara biakan murni untuk tujuan sub culturing. Dengan cara yang sama, pada saat mem-beku tidak dibuat miring tetapi te-gak sehingga menghasilkan agar deep tubes (Gambar 14.6.). Agar ini digunakan terutama untuk mempelajari kebutuhan mikroba akan gas. Agar dalam tabung reaksi dapat dicairkan dalam water bath mendidih dan dituang-kan ke cawan petri sehingga menghasilkan lempengan agar (agar plate)(Gambar 14.7.). Agar ini memiliki permukaan lebih luas untuk isolasi dan mempelajari mikroba. Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 281 Gambar 14.5. Agar miring Gambar 14.6. Agar deep tube Gambar 14.7. Lempengan agar pada cawan petri 14.2.3 Fungsi Media Media merupakan tempat yang baik untuk tumbuhnya mikroba, karena media memiliki nutrien yang dibutuhkan oleh mikroba untuk tumbuh dan berkembang. Media ada yang bersifat umum dan ada yang khusus. Media yang bersifat khusus untuk mem-bantu mengisolasi dan mengiden-tifikasi mikroba spesifik. Untuk tujuan khusus, media dapat diba-gi menjadi (a) selektif; (b) dife-rensial, (c) enrichment, dan (d) kombinasi media selektif dan di-ferensial. a. Media Selektif Media selektif dibuat dengan pe-nambahan senyawa kimia yang dapat menghambat satu kelom-pok mikroba yang lain namun memacu pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contoh berikut-nya dari Eropa adalah Columbia CNA. Agar yang mengandung antibiotik yang dapat mengham-bat pertumbuhan gram negatif, namun tidak terhadap bakteri gram positif (Gambar 14.8). b. Media Differensia Media differensi mengandung ba-han tambahan yang dapat me-nyebabkan perubahan warna me-dia apabila terjadi reaksi kimia tertentu. Media ini digunakan un-tuk membedakan bakteri berda-sarkan karakteristik biokimia. Pe-rubahan warna dalam koloni disebabkan oleh fermentasi bak-Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 282teri terhadap laktosa, dimana bila tidak berwarna menunjukan ada-nya enzim laktosa non fermenter. c. Media Diperkaya Media diperkaya mengandung aditif yang menghambat pertum-buhan dan membantu meningkat-kan pertumbuhan organisme ter-tentu d. Kombinasi media selektif dan differrencial Kombinasi media selektif dan dif-ferensia memungkinkan meng-hambat pertumbuhan mikroba yang satu dengan pertumbuhan lainnya Gambar 14.8. Berbagai Media Selektif Sumber : Berbagai sumber 14.3 Inokulasi Inokulasi adalah teknik pemin-dahan mikroba dari satu media ke media lainnya secara subcul-ture. Bentuk subculture ada yang menggunakan kaldu sebagai me-dia dan agar miring, tegak, atau lapisan. Inokulasi merupakan tek-nik yang penting dan banyak di-gunakan dalam penyiapan dan pemeliharaan kultur stok dan pro-sedur pengujian mikroba. Prosedur transfer kultur adalah sebagai berikut : 1. Jarum atau ose inokulasi ha-rus selalu disterilisasi dengan menahannya di bagian terpa-nas dari api pembakar Bun-sen hingga kawat menjadi merah panas. Dalam keada-an panas, loop jangan pernah dimasukkan ke media berisi mikroba akan tetapi diperta-hankan dahulu di udara sela-ma 10-20 detik hingga mendi-ngin. 2. Tabung kultur stok dan ta-bung yang akan diinokulasi dipegang dalam telapak ta-ngan dan ditahan dengan jari jempol. Kedua tabung mem-bentuk huruf V. Kedua dibu-ka dengan mengambil tutup pertama dengan jari keling-king dan tutup kedua dengan jari tengah. Selama dibuka, kedua tutup harus tetap diper-tahankan di tangan yang se-dang memegang jarum atau ose steril. 3. Setelah tutup dilepas, leher tabung dilewatkan secara ce-pat melalui api. 4. Peralatan transfer yang sudah steril didinginkan lebih lanjut dengan menyentuhkannya ke dinding bagian dalam dari ta-Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 283bung kultur yang sudah steril sebelum mengambil sampel inokulum. 5. Tergantung media kultur, ja-rum atau ose digunakan un-tuk mengambil inokulum. Jarum ose umumnya diguna-kan untuk mengambil contoh kultur dari kultur kaldu (broth culture). Salah satu alat dapat digunakan untuk me-ngambil inokulum dari kultur agar miring (agar slant cul-ture) dengan menyentuh-kan secara hati-hati ke per-mukaan media padat di dae-rah yang terlihat ada pertum-buhan jadi jangan mencungkil agar. Jarum selalu digunakan bila memindahkan mikroba ke agar deep tube baik dalam bentuk kultur cair atau padat. 6. Ose atau jarum yang telah mengandung sel dimasukan ke tabung subculture. Dalam media kaldu, ose atau jarum digoyang secara perlahan untuk melepaskan mikroba; dalam medium agar miring (agar slant culture) keduanya menggambar tipis diatas per-mukaan yang telah mengental sebuah garis lurus atau zig-zag. Untuk inokulasi pada agar deep tube, jarum dima-sukkan ke dasar tabung de-ngan membentuk garis lurus dan secara cepat menggam-bar sepanjang garis lurus ter-sebut. 7. Setelah inokulasi, peralatan dikeluarkan, leher tabung di-panaskan kembali, dan tutup dipasang kembali seperti se-mula. 8. Ose dan jarum dipanaskan kembali untuk membunuh mi-kroba yang ada. 14.3.1 Isolasi Koloni Diskret dari Kultur campuran Teknik yang umum digunakan untuk mengisolasi koloni diskret didasari oleh kebutuhan akan or-ganisme tertentu. Dengan demi-kian mulai dikembangkan apa yang disebut kultur murni. Untuk membuat kultur murni dari kultur campuran harus dilakukan dua langkah utama, yaitu : 1) kultur campuran diencerkan sehingga mikroba secara individual menja-di terpisah cukup jauh pada per-mukaan lempeng agar, sehingga setelah masa inkubasi masing-masing koloni dapat dipisahkan dari lainnya. Lempeng agar se-perti ini disebut lempeng isolasi dan 2) mikroba yang sudah di-pisahkan dari lempeng isolasi selanjutnya dipindahkan ke me-dia steril lainnya. Setelah diinku-basi, semua organisme di media kultur yang baru akan tumbu ber-sama dengan jenisnya. Kultur ini dikenal sebagai kultur murni. 14.3.1.1. Metode streak-plate Metode streak-plate (lempeng go-res) adalah teknik menumbuhkan mikroba di dalam media agar dengan cara menggores (streak) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur mikroba. Dengan teknik ini mikroba yang tumbuh Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 284akan tampak dalam jalur gores-an bekas dari streak jarum ose. Teknik isolasi mikroba ini dapat dianggap cepat secara kualitatif. Ini merupakan teknik pengencer-an penting yang melibatkan pe-nyebaran satu ose kultur ke per-mukaan lempengan agar. Ada beberapa cara untuk meng-goreskan mikroba ke media agar, diantaranya adalah penggoresan four way atau quadrant streak. Adapun cara kerja metode lem-peng gores adalah sebagai beri-kut : a) Tuang media agar cair ke da-lam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Bagi tiga bidang permukaan atas cawan petri yang akan digores dengan spidol atau lainnya. c) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah. d) Panaskan bibir tabung reaksi yang berisi kultur mikroba de-ngan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api. e) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi untuk mengambil mikroba, lalu se-gera keluarkan. Usahakan ke-tika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan selalu di-lakukan dekat pembakar bun-sen. f) Goreskan ke atas permukaan agar dalam cawan petri se-cara perlahan-lahan. Usaha-kan jangan sampai agar han-cur atau tergores. g) Letakkan ose yang telah beri-si mikroba di atas permukaan agar pada daerah 1 hingga mikrobanya menempel pada permukaan agar. h) Ose dibakar hingga berpijar dan dinginkan. Letakkan ose pada lempengan agar dimana terdapat mikroba dan gosok-an secara cepat beberapa kali ke permukaan daerah 1. i) Bakar kembali ose hingga berpijar dan dinginkan. Putar cawan petri hingga membuat sudut 90o dengan daerah 1. Sentuhkan ose ke media kul-tur di daerah 1, dan gosokan beberapa kali ke media agar di daerah 2. j) Bakar kembali ose dan di-nginkan. Putar kembali ca-wan petri hingga membentuk sudut 90o dengan daerah 2. Ambil mikroba dari daerah 2 dan goreskan di daerah 3 dengan cara yang sama seperti di daerah 2 (Gambar 14.9). Next >