< PreviousAnalisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 285 Gambar 14.9. Isolasi mikroba dengan metode lempeng gores Sumber : www.thesciencefair.com/Merchant2/merchant.mvc... k) Tanpa membakar kembali ose, putar kembali cawan pe-tri hingga membuat sudut 90o dengan daerah 3. Ambil mikroba dari daerah 3 dan goreskan ke daerah 4 dengan membentuk garis yang lebar. l) Bungkus cawan petri dengan kertas coklat, inkubasi dalam inkubator dan amati koloni yang terbentuk. 14.3.1.2 Teknik spread-plate Teknik spread-plate (lempeng sebar atau juga sering disebut spin plate) membutuhkan campuran mikroba yang dilarutkan terlebih dahulu. Selama inokulasi, sel akan disebar ke seluruh permukaan medium agar padat dengan steril. Penyebaran mikroba dilakukan dengan menggunakan L-shaped bent rod dimana cawan petri diletakan pada ”lazy-susan” turntable sehingga dapat diputar hingga 360o (Gambar 14.10). Gambar 14.10. Inokulasi mikroba dengan metode lempeng sebar Sumber : www.thesciencefair.com/Merchant2/merchant.mvc... Adapun tahapan inokulasi mikroba dengan metode lempeng sebar adalah ebagai berikut : a) Letakan bent glass rod ke dalam gelas beaker dan tambahkan etil alkohol 96 % hingga menggenangi bagian bawah bent. b) Dengan ose yang telah disterilkan, ambil satu ose penuh kultur mikroba dan letakan ke bagian pusat dari agar plate. Pasang kembali tutupnya. c) Keluarkan glass rod dari gelas beaker dan bakar di api pembakar Bunsen. Posisi bagian bent dari glass rod Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 286harus selalu di bagian bawah untuk mencegah alkohol yang terbakar mengalir ke tangan. Biarkan hingga alkohol yang terbakar mati semuanya. d) Dinginkan rod selama 10-15 detik. Buka tutup cawan petri dan putar pada ”lazy-susan” turntable. Selama ”lazy-susan” turntable berputar, sentuhkan bent rod steril ke permukaan agar. Gerakan di-ulangi kembali sehingga kul-tur mikroba menjadi tersebar di permukaan media agar. e) Bila gerakan berputar ”lazy-susan turntable” telah ber-henti, letakkan kembali tutup cawan petri. Rendam rod da-lam alkohol dan bakar kem-bali. Selain menggunakan L-shaped bent rod, teknik lempeng sebar juga dapat dikerjakan dengan menggunakan pipet dan metode swab. Adapun cara kerja lem-peng sebar menggunakan pipet adalah sebagai berikut : a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Pipet beberapa ml kultur mikroba dan campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan pengenceran yang dikehendaki. c) Aduk campuran hingga me-rata dengan cara memutar tabung reaksi pada telapak tangan selama beberapa kali. d) Pipet larutan pengenceran tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri. e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja untuk meratakan larutan dilusi tadi di atas permukaan media agar. f) Lakukan proses inkubasi dan amati pertumbuhan koloni mikroba. Adapun cara kerja lempeng sebar menggunakan metode swab (usap) adalah sebagai berikut : a. Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b. Pipet beberapa ml kultur mikroba dan kemudian cam-purkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki. c. Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selaa beberapa kali. d. Masukkan swab stick (tangkai apus) steril ke dalam tabung reaksi hingga bagian kapas-nya tenggelam di dalam la-rutan dilusi. Usahkan mema-sukkan tangkai apus jangan Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 287sampai menyentuh dinding tabung reaksi. e. Apus ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan seca-ra merata. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores. f. Lakukan proses iInkubasi dan amati pertumbuhan koloni mikroba. 14.3.1.3 Teknik Pour Plate Teknik pour-plate (lempeng tu-ang) adalah teknik inokulasi mi-kroba di dalam media agar de-ngan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan kultur mikroba. Teknik lempeng tuang biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroba yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Adapun tahan kerja teknik lem-peng tuang adalah sebagai beri-kut : a) Pipet beberapa ml kultur mik-roba dan campurkan dengan beberapa ml aquades sesuai dengan pengenceran yang di-kehendaki. b) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi menggunakan kedua telapak tangan selama beberapa kali. c) Pipet larutan tersebut seba-nyak + 1 ml ke dalam cawan petri. d) Tuang media agar yang ma-sih cair (suhu + 50oC) ke dalam cawan petri tersebut (Gambar 14.11). e) Putar cawan petri secara per-lahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan kultur mikroba. f) Lakukan proses inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri. Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 288menggunakan isolat yang berasal dari campuran kultur agar streak-plate dan/atau spread plate. Adapun prinsipnya adalah koloni yang telah disebar dengan baik akan berkembang pada permuka-an media agar. Masing-masing mikroba dapat dipindahkan de-ngan jarum steril dan ditum-buhkan pada media agar miring (agar slant). Masing-masing me-dia agar miring mewakili pertum-buhan dari satu spesies mikroba dan dirancang sebagai kultur murni atau cadangan (stock). Pembuatan media agar miring adalah sebagai berikut : a) Tuang media agar ke dalam tabung reaksi secara aseptis dan b) Dinginkan agar pada tabung re-aksi dalam keadaan miring (+ 20-300) Prosedur pembuatan kultur murni pada media agar miring adalah sebagai berikut : a) Gunakan pinsil lemak untuk menandai tabung reaksi berisi nutrien agar miring. b) Transfer secara aseptik mi-kroba dari media streak-plate dan/atau spread plate dengan prosedur sebagai berikut : (1) Bakar jarum ose hingga ka-wat berpijar merah dan di-inginkan; (2) Setelah dingin, sentuhkan jarum ke koloni mi-kroba yang diingin-kan pada agar lempeng gores / sebar; 3) Buka tutup tabung agar miring dan lewatkan le-her tabung secara cepat me-lalui api pembakar Bunsen; 4) Inokulasi agar miring dengan cara menggeser jarum ose dari bawah ke arah atas membentuk gerakan zigzag sepanjang permukaan agar. Jangan sampai menggali ke dalam media agar atau me-rusak permukaan media agar. c) Panaskan kembali leher ta-bung reaksi dan tutup kem-bali. d) Bakar jarum inokulasi dan simpan. e) Inkubasi ke dalam inkubator dan amati bentuk koloni yang tumbuh. Lama proses inku-basi juga mempengaruhi per-hitungan mikroba. Perhitung-an mikroba yang diinkubasi-kan selama 18 jam memberi-kan hasil lebih baik dibanding-kan 24 jam. Namun demiki-an, beberapa mikroba mem-butuhkan masa inkubasi lebih lama lagi. 14.4 Pengujian Mikrobiologi 14.4.1 Penanganan Sampel Pengambilan dan penanganan sampel, termasuk pengenceran, merupakan bagian penting dalam analisis mikroba pada bahan pa-ngan. Pengambilan sampel ha-rus sedemikian rupa sehingga dapat mewakili keseluruhan ba-han pangan. Sampel yang telah diambil harus disimpan dalam wadah tertutup untuk mencegah terjadinya kon-taminasi. Pengambilan sampel Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 289harus dapat dilakukan dengan menggunakan teknik aseptik dan peralatan yang steril. Sterilisasi peralatan selama di lapangan dapat dilakukan dengan pencuci-an dan pembakaran dengan pro-pana. Penggunaan alkohol seba-gai anti septik dikhawatirkan akan menyebabkan kebakaran. Wadah yang digunakan untuk menyimpan sampel harus bersih, kering, mempunyai tutup besar dan mampu menyimpan sampel dengan bobot 100 g atau lebih. Kantong plastik sering digunakan sebagai wadah sampel. Jangan menulis informasi data sampel langsung ke kantong plastik, teta-pi gunakan lakban atau kertas label. Data sampel yang dicantumkan pada lakban atau kertas label antara lain : 1) tempat, hari, tanggal dan jam pengambilan sampel; 2) uji mikrobiologis yang akan diterapkan; 3) nama dan alamat perusahaan pemohon; 4) kode atau jumlah sampel; 5) deskripsi sampel; 6) nama dan tanda tangan kolektor; 7) hari, tanggal, dan jam diterima di labo-ratorium; atau 8) tanda tangan orang yang menerima sampel di laboratorium. Semua informasi ini mempengaruhi interpretasi dan hasil akhir. Sampel yang dikirim ke labora-torium untuk dianalisa harus di-pertahankan seperti dalam kondi-si tempat asalnya. Sampel beku atau dingin harus dipertahankan tetap beku/dingin hingga tiba di laboratorium Pengiriman sampel dilakukan sesegera mungkin. Pada saat akan dianalisis, sam-pel beku harus dicairkan dengan cara menyimpannya selama 18 jam pada suhu 2o-5oC dan segera ditangani. Secara umum, semua sampel harus sudah dianalisis dalam waktu 36 jam sejak dite-rima di laboratorium. 14.4.2 Pengujian Morfologis Inokulasi mikroba pada agar mi-ring adalah untuk melihat karak-teristik koloni bakteri yang tum-buh. Tiap bakteri memiliki karak-teristik morfologi yang berbeda (Tabel 14.2.). 14.4.3 Pewarnaan Mikroba Mikroba berukuran kecil dan ter-lihat transparan atau tidak ber-warna, sehingga sering menim-bulkan kesulitan dalam pengama-tan. Untuk mengatasi hal terse-but, mikroba harus diwarna terle-bih dahulu. Pewarnaan dapat dilakukan de-ngan dua cara, yaitu pewarnaan asam dan basa. Pewarnaan asam yang terdiri dari garam natrium, kalium, kalsium, atau ammonium yang bersifat negatif. Pewarnaan basa yang terdiri dari garam klorida dan sulfat yang bersifat positif. Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 290Tabel 14.2. Karakteristik Pertumbuhan Koloni Bakteri Karakter Deskripsi Ukuran Diameter koloni yang diukur di dalam mm cm Bentuk Keseluruhan Koloni Sirkular, irregular, punctiform, rhizoid Tepi / Margin Entire, lobate, erose, undulate Elevasi Datar (flat), raised, convex (cembung), pulvinate, umbonate, crateriform Permukaan Wrinkled, rough (kasar), concentric rings, dull, glistening, seperti berlemak Pigmentasi merah, kuning, krim, putih, tidak berwarna Kelarutan dalam air larut dalam air, tidak larut dalam air Opasitas Transparan, translucent, opaque Bau manis, busuk, menyerupai bau buah Teknik pewarnaan mikroba dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu pewarnaan sederhana dan dife-rensial. Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang hanya menggunakan satu pewarna saja. Pewarnaan sederhana (Gambar 14.12) dilakukan untuk melihat bentuk morfologis mikroba (apa- kah koma, batang, spiral atau bulat) dan bentuknya (apakah berbentuk rantai, berpasangan, berempat (tetrad) atau banyak (kluster)). Pewarnaan diferensial adalah pe-warnaan yang menggunakan dua zat pewarna. Pewarnaan diferen-Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 291sial dimaksudkan untuk mengha-silkan warna yang kontras antara komponen yang akan diamati dengan sekelilingnya, sehingga akan memberi kemudahan dalam pengamatan mikroba (Gambar 14.13). Gambar 14.12. Pewarnaan sederhana ditujukan untuk mengamati bentuk morfologis mikroba Sumber : Dennis Kunkel Microscopy, Inc. Pewarnaan diferensial dapat dibagi dua, yaitu : (1) untuk memi-sahkan kelompok mikroba sehingga dikenal pewarnaan Gram dan pewarnaan asam; dan 2) untuk melihat struktur mikroba sehingga dikenal pewarnaan fla-gel, kapsul, spora, atau inti sel. 14.4.4 Pengujian Turbiditas Pengujian turbiditas serupa de-ngan teknik agar miring, namun teknik ini menggunakan media broth (kaldu) dan yang diamati adalah karakteristik kekeruhan-nya. Tiap mikroba memiliki karak-teristik turbiditas (kekeruh-an) yang berbeda-beda. Ada diantara mikroba yang membentuk partikel melayang (flocculent) di dalam media broth. Ada yang terse-dimentasi, melayang di per-mukaan saja (pellicle) dan ada pula yang melayang di permuka-an berbentuk seperti cincing (ring). Gambar 14.13. Pengamatan inti sel dengan pewarnaan diferensial Sumber : Dennis Kunkel Microscopy, Inc. Pengujian turbiditas dapat dilaku-kan dengan cara berikut : a) Tuang media kaldu ke dalam tabung reaksi secara aseptis b) Ambil mikroba dengan cara menggoresnya dari kultur bi-akan mikroba. c) Transfer dengan cara meng-goreskan ke dalam tabung re-aksi yang berisi kaldu tadi d) Lakukan inkubasi di dalam in-kubator dan amati bentuk ko-loni yang tumbuh Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 29214.4.3 Teknik Pengenceran Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Kare-na hampir semua metode perhi-tungan jumlah sel mikroba mem-pergunakan teknik ini, seperti TPC (Total Plate Count). Adapun cara pengenceran popu-lasi mikroba adalah sebagai beri-kut : a) Ambil 1 ml larutan media kultur mikroba dan masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh pengenceran 1/10 bagian. b) Dari larutan pengenceran 1/10, ambil 1 ml dan ma-sukkan ke dalam 9 ml aqua-des atau larutan buffer pepton untuk memperoleh di-lusi 1/100 bagian. c) Dari larutan pengenceran 1/100, ambil 1 ml dan ma-sukkan ke dalam 9 ml aqua-des atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1000 bagian. d) Dari larutan pengenceran 1/1000, ambil 1 ml dan ma-sukkan ke dalam 9 ml aqua-des atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian dan seterus-nya hingga diperoleh pengen-ceran 1/1.000.000. e) Tujuan pengenceran media dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 dst adalah apabila tiap media pengenceran di-tumbuhkan ke dalam suatu media, maka koloni yang tum-buh dapat dihitung sehingga jumlah sel mikroba dapat di-ketahui dengan persamaan : Jumlah sel mikroba =Jumlah koloni x 1/Pengenceran Misal : Apabila pada dilusi 1/100 tumbuh sebanyak 20 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel adalah : Jumlah sel mikroba =Jumlah koloni x 1/Pengenceran = 20 x 1/ (1/100) = 2000 sel Apabila pada dilusi 1/1000 tum-buh sebanyak 3 koloni, maka jumlah sel mikroba dapat dihitung dengan menggunakan rumus : Jumlah sel mikroba =Jumlah koloni x 1/Pengenceran = 3 x 1/(1/1000) = 3000 sel 14.5. Menghitung populasi mikroba Populasi mikroba dapat dihitu-ngan dengan dua cara, yaitu menghitung secara langsung dan Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 293tidak langsung. Penghitungan se-cara langsung dipengaruhi oleh pelarut yang digunakan, suhu, dan lama proses inkubasi. Media yang umum digunakan berupa air steril, air garam steril, buffer fosfat steril, dan 0.1 % pepton steril. Penggunaan air steril dan garam steril dapat merusak beberapa bakteri. Ba-han pangan dari laut membutuh-kan pelarut 3 % NaCl, karena beberapa mikroba membutuhkan garam. Suhu inkubasi berpengaruh ter-hadap hasil penghitungan popu-lasi mikroba. Suhu inkubasi ber-kisar 25o– 30o C memberikan ha-sil perhitungan yang lebih tinggi dibandingkan suhu 37oC. Apabila hendak menumbuhkan Pseudo-monas atau Bacillus, maka pro-ses inkubasi sebaiknya menggu-nakan suhu rendah. Penghitungan mikroba secara langsung dapat dilakukan dengan cara : 14.5.1 menghitung jumlah sel mikroba yang terlihat di bawah mikroskop. Jumlah sel mikroba yang terlihat di bawah mikroskop dapat dihi-tung dengan cara : a. Menghitung secara mikrosko-pis jumlah mikroba dalam co-ntoh dengan volume yang sangat sedikit dan terukur. Penghitungan dilakukan de-ngan menggunakan kotak penghitung (counting cham-ber). Kotak penghitung terdiri dari kotak-kotak kecil dengan ukuran dan luas tertentu. Cairan contoh yang diketahui volumenya, diletakan di kotak penghitung dan ditutup de-ngan gelas penutup. Dengan volume contoh yang diketahui dan jumlah mikroba pada tiap kotak pada kotak penghitung diketahui, maka populasi mi-kroba dapat diketahui b. Menghitung jumlah sel total secara mikroskopis dengan menggunakan contoh yang telah diwarnai. Kelemahan dari penghitungan populasi mikroba secara lang-sung antara lain : a. Sel mikroba yang sudah mati tidak dapat dibedakan dari yang masih hidup b. Sel yang berukuran kecil sulit dihitung atau terlewat sehing-ga hasil perhitungan membe-rikan hasil dibawah angka se-benarnya. c. Kurang peka karena suspensi contoh harus mengandung minimal 106 sel per ml. d. Ketepatan yang tinggi sukar diperoleh. e. Suspensi contoh harus bebas dari zat lain karena dapat me-nutupi sel pada saat dihitung. 14.5.2 Menghitung sel hidup Jumlah mikroba yang hidup dapat dihitung menggunakan metode penghitungan secara langsung Analisis Mikrobiologis Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 294dan tidak langsung. Menghitung secara langsung jumlah sel mi-kroba yang hidup terhadap waktu (Total Plate Count) atau Menghitung mikroba secara tidak langsung berdasarkan turbiditas. Prosedurnya lebih cepat namun harus membuat kurva standarnya terlebih dahulu. 14.5.2.1 Pertumbuhan dalam agar Berdasarkan anggapan bahwa satu sel mikroba akan tumbuh dan berkembang menjadi popula-si, maka prinsip dasar dari meng-hitung mikroba adalah satu koloni mikroba mewakili satu sel mikro-ba. Sampel dari bahan atau produk pangan yang sudah dihomogeni-sasi diinokulasi ke dalam atau permukaan media agar. Setelah diinkubasi, koloni mikroba yang tumbuh dihitung sebagai jumlah mikroba. Proses inokulasi contoh ke media agar dapat dilakukan dengan ca-ra penuangan, penyebaran, dan penetesan. Pada cara penuangan, 1 ml contoh dipindahkan ke dasar cawan petri dan 15-20 ml media agar cair dituangkan di atasnya. Untuk mencegah kematian mi-kroba contoh, suhu media agar cair yang dituangkan berkisar 45o – 50oC. Bila suhunya terlalu rendah akan menyulitkan karena sudah mulai mengental. Selan-jutnya cawan petri digeserkan di permukaan meja dengan mem-bentuk pola angka delapan agar contoh tersebar merata di seluruh media agar. Inkubasikan di da-lam inkubator. Metode ini paling peka karena mampu menghitung mikroba sampai kepadatan 20 sel/ml. Metode ini kurang praktis digunakan di lapangan karena membutuhkan peralatan untuk mencairkan dan membekukan media agar. Pada cara penyebaran, 0.1 ml contoh disebar secara merata di permukaan media agar (spread plate method) dengan menggu-nakan tongkat gelas melengkung (bent glass rod). Selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam inkubator. Metode ini dapat digu-nakan di lapangan karena media agarnya sudah disiapkan terlebih dahulu. Jumlah mikroba yang dapat dihitung dengan metode ini harus mempunyai kepadatan mi-nimal 300 sel/ml. Pada cara penetesan, media agar pada cawan petri dibagi menjadi 3-4 sektor dengan mem-beri garis di dasar cawan petri. Larutan contoh sebanyak 0.02 ml diteteskan di masing-masing sek-tor. Setelah contoh mengering, lakukan inkubasi di dalam inku-bator. Keuntungan dari metode ini adalah proses penghitungan dapat diulang sesuai jumlah sek-tor yang dibuat. Keuntungan dari metode pertum-buhan agar adalah dapat diketa-Next >