< Previous 78 Jika terjadi hanya satu perambatan (seperti rantai) maka koloni dianggap satu. Jika terbentuk satu atau lebih rantai terbentuk dan berasal dari sumber yang terpisah-pisah, maka uap sumber dihitung sebagai satu koloni. Cara membulatkan angka: Dalam melaporkan jumlah koloni atau jumlah koloni perkiraan hanya 2 angka penting yang digunakan, yaitu angka pertama dan kedua (dimulai dari kiri), (a) Jika angka ketiga lebih besar dari 5, maka bulatkan ke atas; contohnya : 528 dilaporkan sebagai 530 penulisannya 5,3 x 102 (b) Jika angka ketiga kurang dari 5, maka bulatkan kebawah; dan contohnya : 523 dilaporkan sebagai 520 penulisannya 5,2 x 102 (c) Jika angka ketiga sama dengan 5, maka bulatkan sebagai berikut (1) bulatkan ke atas jika angka kedua merupakan angka ganjil; dan contohnya: 575 dilaporkan sebagai 580 penulisannya 5,8 x 102 (2) bulatkan ke bawah jika angka kedua merupakan angka genap contohnya : 565 dilaporkan sebagai 560 penulisannya 5,6 x 102 (3) Escherichia coli Prinsip: Pertumbuhan Escherichia coli ditandai dengan terbentuknya gas pada tabung Durham, yang diikuti dengan uji biokimia dan selanjutnya dirujuk pada Tabel APM (Angka Paling Mungkin). 79 Peralatan: (a) Inkubator (35 ± 1) °C; (b) Penangas air tertutup dengan sistem sirkulasi, (45,5 ± 0,2) °C; (c) Rak untuk tabung reaksi; (d) Pipet ukur 10 mL dan 1 mL berskala 0,1 mL; (e) Botol pengencer terbuat dari gelas borosilikat, dengan tutup ulir/plastik; (f) Tabung reaksi dan tabung Durham; (g) Cawan petri gelas ukuran 15 mm x 100 mm atau plastik ukuran 15 mm x 90 mm, steril; dan (h) Jarum ose (inokulasi), dengan diameter dalam kira-kira 3 mm. Perbenihan pengencer dan pereaksi: (a) Lauryl sulfate tryptose (LST) broth / Lauryl tryptose (LT) broth; (b) Brilliant green lactose bile (BGLB) broth 2 %; (c) Escherichia coli (EC) broth; (d) Levine's eosin methylene blue (L-EMB) agar; (e) Plate count agar (PCA); (f) Gram stain; (g) Tryptone (tryptophane) broth; (h) Pereaksi kovacs’; (i) Methyl red – voges proskauer (MR – VP) broth; (j) pereaksi voges proskauer; (k) Larutan methyl red; (l) Koser's citrate broth; (m) Peptone diluents 0.1 %; (n) Pereaksi indole; 80 (o) larutan kalium hidroksida 40 %; (p) Buffer fields phosfat buffered dilution water; (q) Larutan alpha naphtol 5 %; dan (r) Kristal kreatin. Cara kerja: APM – Uji pendugaan untuk Escherichia coli: (a) Lakukan persiapan dan homogenisasi contoh seperti pada 10.1, (b) Inokulasikan masing-masing 1 ml larutan dari setiap tingkat pengenceran (larutan 10-1, 10-2 dan 10-3) ke dalam tiga tabung Laurryl sulfate tryptose (LST) broth yang didalamnya terdapat tabung durham terbalik. Pegang pipet sedemikian sehingga ujung bawah pipet menempel pada tabung. Biarkan isi pipet mengalir 2 detik sampai dengan 3 detik. Pipet jangan ditiup untuk mengeluarkan isinya, (c) Masukkan tabung-tabung tersebut ke dalam inkubator pada suhu 35°C selama (48 ± 2) jam, (d) Amati tabung-tabung tersebut pada pada jam ke-(24 ± 2). Jika ada tabung yang telah mengandung gas, keruh maka tabung tersebut dinyatakan dzpositifdz, (e) Tabung-tabung yang belum mengandung gas dinyatakan Dznegatifdz, lanjutkan inkubasi selama ʹͶ jam, (f) Catat adanya pembentukan gas setelah inkubasi (48 ± 2) jam, dan nyatakan tabung tersebut Dzpositifdz, dan (g) Lakukan uji penegasan terhadap semua tabung yang positif untuk uji pendugaan. 81 APM – Uji penegasan untuk Escherichia coli: (a) Pindahkan satu mata Ose dari setiap tabung LST yang positif ke dalam tabung EC broth yang berlainan, (b) Inkubasikan tabung-tabung EC tersebut ke dalam penangas air yang bersirkulasi, selama (24 ± 2) jam pada suhu (45,5 ± 0,2) °C, tabung yang telah terbentuk gas dinyatakan Dzpositifdz, (c) Apabila negatif, inkubasikan dan periksa kembali pada jam ke-(48 ± 2). Jika telah terbentuk gas maka tabung tersebut dinyatakan "positifdz, dan (d) Lakukan uji lengkap terhadap semua tabung yang positif untuk uji penegasan. Uji lengkap untuk Escherichia coli: (a) Kocok tabung-tabung EC broth yang positif secara hati-hati, (b) Ambil koloni sebesar satu mata Ose, kemudian digoreskan/ditanamkan pada satu cawan agar L-EMB, sedemikian rupa hingga dihasilkan koloni yang terpisah-pisah dengan jarak minimum 0,5 cm, (c) Inkubasikan cawan L-EMB tersebut selama 18 jam sampai dengan 24 jam pada suhu (35 ± 1) °C, (d) periksa cawan-cawan terhadap adanya koloni yang berwarna hijau dengan atau tanpa kilat logam, (e) Dari tiap cawan L-EMB, pindahkan maksimal 5 koloni yang mencurigakan pada tabung agar miring PCA, (f) Inkubasikan tabung-tabung agar miring tersebut selama 18 jam sampai dengan 24 jam pada suhu 35 °C dan gunakan untuk uji selanjutnya, (g) Buatlah pewarnaan Gram dari tiap biakan. E coli adalah gram negatif dan berbentuk batang tak berspora yang harus diuji 82 menggunakan reaksi-reaksi IMVIC seperti dibawah ini serta harus diinokulasikan kembali ke tabung LST broth untuk menegaskan adanya produksi gas, Uji indol inokulasi tabung tryptone broth, inkubasi selama (24 ± 2) jam pada suhu 35 °C, uji adanya indol dengan menambahkan 0,2 ml sampai dengan 0,3 ml pereaksi Kovacs’, dan uji indol positif bila lapisan atas berwarna merah pada lapisan atas. Uji Voges Proskauer inokulasi tabung medium MR-VP broth dari setiap tabung PCA dan inkubasikan selama (48 ± 2) jam pada suhu 35°C, pindahkan 1 ml biakan secara aseptis ke dalam tabung reaksi steril, tambahkan 0,6 ml larutan 5 % alpha naphtol dalam alkohol, 0,2 ml larutan KOH 40 % dan beberapa butir kristal kreatin, dan uji Voges Proskauer positif bila terbentuk warna eosin merah muda dalam waktu 2 jam. Uji Methyl red setelah uji VP, inkubasikan kembali tabung MR-VP broth selama 48 jam pada suhu 35 °C; tambahkan 5 tetes indikator methyl red pada setiap tabung, dan uji MR positif bila terbentuk warna merah, dan negatif bila terbentuk warna kuning. Uji Sitrat Inokulasi tabung Koser's citrate broth dengan hati-hati menggunakan jarum lurus sedemikian rupa sehingga hanya 83 mengenai permukaan media. Terlalu banyak inokulasi dapat menyebabkan terbawanya zat-zat lain, inkubasikan selama 96 jam pada suhu suhu 35 °C, dan uji sitrat positif bila terbentuk kekeruhan yang menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri dalam tabung. Uji pembentukan gas dari Lactase inokulasikan tabung LST broth dari setiap agar miring PCA. Inkubasikan selama (48 ± 2) jam pada suhu 35 °C, dan periksa tabung tabung itu terhadap adanya pembentukan gas. Klasifikasi dan laporan Tabel 12. Reaksi biokimia E. coli pada uji IMVIC Jasad Indol Methyl Red Voges Proskaeur Sitrat Escherichia Coli Varitas I Varitas II + - + + - - - - Klasifikasikan sebagai E. coli apabila (1) Uji IMVIC mengikuti pola + + - - atau - + - -, sesuai dengan Tabel 10 (2) Terbentuknya gas dalam broth dengan waktu inkubasi (48 ± 2) jam pada suhu 35 °C Hitunglah APM E. coli dengan menggunakan Tabel 11 APM berdasarkan jumlah tabung - tabung dari 3 seri pengenceran yang telah dipastikan mengandung E. coli. 84 Tabel 13. APM/ g contoh bila menggunakan 3 tabung untuk setiap tingkat pengenceran 0,1 g/mL; 0,01 g/mL; dan 0,001 g/ml contoh Tabung yang positif APM Tabung yang positif APM 0,1 0,01 0,001 0 0 0 < 3 2 2 0 21 0 0 1 3 2 2 1 28 0 1 0 3 2 2 2 35 0 1 1 6 2 3 0 29 0 2 0 6 2 3 1 36 0 3 0 9 3 0 0 23 1 0 0 4 3 0 1 39 1 0 1 7 3 0 2 64 1 0 2 11 3 1 0 43 1 1 0 7 3 1 1 75 1 1 1 11 1 2 0 11 3 1 3 160 1 2 1 15 3 2 0 93 1 3 0 16 3 2 1 150 2 0 0 10 3 2 2 216 2 0 1 14 3 2 3 290 2 0 2 20 3 3 0 240 2 1 0 15 3 3 1 460 2 1 1 20 3 3 2 1100 2 1 2 27 3 3 3 > 1100 (4) Bacillus cereus Prinsip: Pertumbuhan Bacilus cereus ditandai dengan terbentuknya koloni eosin merah muda penghasil lechitinase, yang diikuti dengan uji konfirmasi pada berbagai media. Peralatan: (a) Inkubator (30 ± 2)°C dan (35 ± 2) °C terkalibrasi; (b) Alat homogenisasi yang sesuai dengan kecepatan putaran 85 18000 rpm sampai dengan 21000 rpm; (c) Penangas air, (48 – 50)°C; (d) Mikroskop; mikroscope slides, dan cover slips; (e) Alat penghitung koloni; (f) Vortex mixer; (g) Bunsen besar dan kecil; (h) Rak tabung biakan; (i) Botol pengencer steril; (j) Tabung anaerobick GasPak; dilengkapi dengan H2 dan CO2 generator envelopes dan katalisnya (k) Tabung biakan, 13 x 100 mm, steril; (l) Pipet ukur 10 ml, 5 ml, dan 1 ml, berskala 0,1 mL steril; (m) Cawan petri berukuran minimal 15 x 100 mm steril; (n) Batang penyebar steril, diameter 3 mm sampai dengan 4 mm dengan area penyebar 45 mm sampai dengan 55 mm; (o) Jarum inokulasi (ose), berukuran 2 mm dan 3 mm; dan (p) Pena penanda. Media dan pereaksi: (a) Agar Mannitol-egg yolk-polymyxin (MYP); (b) Egg yolk emulsion, 50 %; (c) Trypticase soy-polymyxin broth; (d) Larutan polimiksin B untuk MYP agar (0,1 %) dan trypticase soy-polymyxin broth(0,15 %); (e) Lisozim 0,001 %; (f) Phenol red glucose broth; (g) Agar tirosin; (h) Lysozyme broth; (i) Media Voges-Proskauer; 86 (j) Nutrient broth; (k) Nitrate broth; (l) Nutrient agar untuk B. cereus; (m) Sulfanilic acid reagent; (n) Alfa naphthol reagent; (o) Butterfield's phosphate-buffered dilution water yang disterilkan dalam botol dengan volume akhir 450 ± 5 ml dan 90 ± 2 ml; (p) Pereaksi uji Voges-Proskauer; (q) Larutan kalium hidroksida, KOH 40% buffer fosfat; (r) Kristal kreatin; dan (s) Metanol. Persiapan contoh: (a) Timbang 50 g contoh ke dalam blender yang bersih dan steril secara aseptis. Tambahkan 450 ml butterfield's phosphate-buffered dilution water (1:10) dan kocok selama 2 menit pada kecepatan tinggi (18.000 rpm sampai dengan 21.000 rpm), dan (b) Buat seri pengenceran dengan menggunakan larutan butterfield's phosphate-buffered dilution water (1:10). Penetapan Bacillus cereus APM- B. cereus (a) Teknik APM direkomendasikan untuk menghitung Bacillus cereus dalam contoh yang diharapkan mengandung Bacillus cereus lebih kecil dari 10 per gram contoh; (b) Inokulasikan masing-masing 1 mL larutan dari setiap tingkat pengenceran (larutan 10-1, 10-2 dan 10-3) ke dalam tiga tabung trypticase soy-polymyxin broth; 87 (c) Inkubasikan tabung-tabung tersebut dalam inkubator pada suhu 30°C selama (48±2) jam; (d) Amati tabung-tabung tersebut pada pada jam ke-(48 ± 2) untuk melihat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus; (e) Gores biakan dari tabung yang positif dengan Ose ke dalam media MYP agar dan inkubasi selama 24 jam sampai dengan 48 jam pada suhu 30 °C; (f) Ambil 1 atau lebih koloni yang berwarna eosin merah muda dengan lechitinase positif dari media agar MYP dan pindahkan ke media miring NA untuk uji penegasan B.cereus; dan (g) Hitunglah APM B. cereus dengan menggunakan Tabel 11 APM berdasarkan jumlah tabung-tabung dari 3 seri pengenceran yang telah dipastikan mengandung B. cereus. Angka lempeng total - Bacillus cereus (a) Buat tingkat pengenceran dari 10-2 sampai dengan 10-4 dengan memindahkan 10 ml contoh yang telah dihomogenkan ke dalam 90 ml larutan pengencer, aduk dengan kuat dan lanjutkan ke pengenceran 10-4, (b) Inokulasi sebanyak 0,1 ml masing-masing tingkat pengenceran (termasuk 1:10) menggunakan batang penyebar steril di atas permukaan media MYP agar, lakukan secara duplo, (c) Inkubasikan media MYP agar pada suhu 30 °C selama 24 jam, (d) Amati koloni yang dikelilingi oleh zona endapan yang menunjukkan bahwa B. cereus menghasilkan lecithinase berwarna merah muda. Warnanya akan menjadi lebih jelas apabila inkubasi dilanjutkan; (e) Jika warna tidak jelas, lanjutkan inkubasi selama 24 jam lagi sebelum perhitungan koloni, Next >