< PreviousAnalisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 355Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, oleh karena itu warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Senyawa fenolik juga dapat membentuk warna biru, sehingga akan mengganggu penghitungan. Untuk menghilangkannya lakukan pengendapan protein dengan TCA, hilangkan supernatan. La-rutkan kembali protein yang diendapkan oleh TCA, baru dianalisis. Pereaksi yang digunakan dalam metode Lowry adalah : 1. Natrium karbonat 2% dalam larutan NaOH 0.1N 2. Tembaga sulfat 0.5% dalam larutan NaK tartrat 1 % (dibuat hanya pada waktu akan digunakan). 3. Campuran 50 ml pereaksi (1) dengan 1 ml pereaksi (2) (hanya pada waktu akan digunakan, hanya stabil sela-ma 1 hari) 4. Pereaksi Folin Ciocalteau (pe-reaksi fenol) Pereaksi ini biasanya tersedia secara komersil, larutkan dengan air 1 : 1 sebelum digunakan. Pereaksi ini dapat dibuat sendiri dengan cara sebagai berikut : Masukkan 100 g natrium tungstat, 25 g natrium molibdat, 500 ml akuades, 50 ml asam fosfat 85% dan 100 ml HCl pekat ke dalam labu 2 liter. Campuran direfuks secara hati-hati selama 10 jam dengan menggunakan kondensor. Sesudah di-dinginkan, tambahkan ke dalam labu 150 g litium sulfat, 50 ml akuades dan beberapa tetes Br2 (Brom). Pendidihan dilanjutkan la-gi selama 10 menit de-ngan tanpa kondenser, untuk menghilangkan ke-lebihan Brom. Setelah didinginkan, vo-lume larutan dijadikan 100 ml dan saring jika perlu. Filtrat tidak boleh ada warna kehijauan. Bila ada maka perlu dilakukan pen-didihan sekali lagi. Ini merupakan ’reagent stok’. Larutkan dengan air 1 : 1 sebelum digunakan. 5. Larutan protein standar 0.25 mg/ml (larutan bivine serum albumin) Cara Kerja : 1. Pembuatan Kurva Standar a. Masukkan ke dalam tabung reaksi : 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml protein standar. Tambah air sampai volume total masing-masing 4 ml. Kedalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 5.5 ml pereaksi (3), campur merata dan biarkan selama 10 – 15 menit pada suhu kamar. Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 356b. Tambahkan 0.5 ml pereaksi (4) ke dalam masing-masing tabung reaksi, kocok merata dengan cepat setelah penambahan. c. Biarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. d. Ukur absorbansinya pada 650 nm e. Buat kurva standar. 2. Persiapan sampel Lakukan seperti mempersiap-kan sampel penetapan pro-tein metode biuret. 3. Penetapan sampel 0.1 – 1 ml sampel dipipet tepat, masukkan kedalam ta-bung reaksi kemudian diperla-kukan seperti penetapan standar. 16.2.1.4 Metode Dye Binding Metode dye binding hanya dapat diterapkan untuk menetapkan kadar protein susu secara tidak langsung, yaitu dengan mengikat zat warna. Untuk menentukan kadar protein, hasil yang diper-oleh harus dikalibrasi dahulu de-ngan metode Kjeldahl. Metode ini didasarkan bahwa zat warna memiliki kemampuan bergabung dengan gugus polar protein yang bermuatan ion ber-lawanan. Senyawa kompleks tidak larut yang terbentuk dipisah-kan dengan cara sentrifugasi atau penyaringan dan kosentrasi zat warna yang tidak terikat dapat diukur densitas optisnya. De-ngan menggunakan kurva stan-dar yang menyatakan hubungan antara densitas optik dengan ka-dar protein yang ditetapkan de-ngan metode Kjeldahl, maka ka-dar protein sampel dapat diten-tukan. Pereaksi dan peralatan Pereaksi yang digunakan pada metode dye binding adalah la-rutan dye. Larutan ini dibuat de-ngan melarutkan 0.6165 g amido black atau 1 g orange G dalam 1 liter asam sitrat 0.3 M. Adapun peralatan utama yang digunakan adalah sentrifus dan spektrofotometer. Cara Kerja a. Encerkan 5 ml susu menjadi 100 ml dengan menambah-kan air. b. Campurkan 5 ml larutan susu dengan 10 ml larutan dye dalam tabung sentrifus 15 ml, kocok. c. Dengan cara yang sama buat blanko, terdiri dari 5 ml air ditambah 10 ml larutan dye. d. Sesudah dibiarkan 10 menit, sentrifus pada 2500 rpm selama 5 menit. Ambil su-pernatannya. e. Encerkan 3 ml supernatan menjadi 100 ml, kemudian ukur densitas optisnya pada 615 nm (amido black) atau 485 nm (orange G). Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 357f. Tentukan kadar protein sam-pel berdasarkan kurva stan-dar hubungan antara densitas optik dengan kadar protein susu yang ditetapkan dengan metode Kjeldahl yang telah dibuat sebelumnya. 16.2.2 Penetapan NPN Penetapan nitrogen non protein dapat diterapkan pada semua jenis bahan pangan. Prinsip kerjanya, sampel diekstrak de-ngan air. Protein yang ada di-endapkan dengan penambahan tembaga asetat dan komponen yang mengandung nitrogen non protein akan tetap berada dalam larutan. Setelah disaring, nitro-gen dalam filtrat ditentukan de-ngan metode Kjeldahl. Peralatan yang digunakan dalam metode NPN adalah : 1. Labu Kjeldahl 800 ml 2. Corong berdiameter 4 inci atau 12 cm 3. Labu Buchner 4. Kertas saring Whatman No. 541 atau S & S No. 1505 berdiameter 18 cm. Adapun pereaksi yang digunakan adalah : 1. Larutan tembaga asetat mo-nohidrat 3 % (w/v) 2. Larutan amonium potasium sulfat 24 H2O 10 % (w/v) 3. Silikon antibusa Cara Kerja 1. Timbang atau pipet sejumlah sampel dengan ketentuan se-bagai berikut : o 2 g untuk sampel yang mengandung protein sampai 25% o 1 g untuk sampel yang mengandung protein 25-50% o 0.5 untuk yang mengan-dung protein di atas 50% 2. Pindahkan sampel ke dalam labu Kjeldahl. 3. Tambahkan kira-kira 50 ml akuades, sedikit batu didih dan 1-2 tetes silikon anti busa. 4. Ekstrak (digest) campuran de-ngan mendidihkannya selama 30 menit (jaga jangan sampai kering). 5. Sementara hasil ekstraksi masih panas, tambahkan 2 ml larutan aluminium sulfat, cam-purkan hingga rata. 6. Panaskan kembali sampai mendidih 7. Tambahkan 50 ml larutan tembaga sulfat, campur me-rata. 8. Biarkan sampai dingin. 9. Saring melalui kertas saring dengan menggunakan corong berdiamater 4 inci dan labu Buchner. Cuci labu Kjeldahl dan endapkan dengan 50 ml air dingin 10. Pindahkan filtrat dari labu Buchner ke dalam labu Kjel-dahl kemudian tetapkan kadar nitrogennya dengan metode Kjeldahl. Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 35816.2.3 Penetapan basa volatil nitrogen dan Trimethylamine (TMA) 16.2.3.1 Penetapan Basa Volatil Nitrogen Prinsip dari metode penetapan basa volatil nitorgen adalah hasil ekstraksi sampel dengan TSA 5% akan mengendapkan seluruh pro-tein yang dikandungnya, sedang-kan seluruh komponen volatil bernitrogen larut dalam larutan TCA. Ekstrak TCA didestilasi sehingga komponen volatil ber-nitrogen diikat oleh larutan HCl 0.01 M. Destilasi ini kemudian dititrasi dengan NaOH 0.01 M sehingga kadar TVNnya dapat ditentukan. Pereaksi yang digunakan dalam penetapan TVN adalah sebagai berikut : 1. Larutan TCA 5% (w/v) 2. NaOH 2 M 3. HCl 0.01 M 4. NaOH 0.01 M 5. Formadehid 15 % (w/v) netral. Encerkan 432.4 ml formal-dehid 37 % menjadi 1 liter de-ngan air. Campurkan 1 L for-maldehid yang sudah dien-cerkan dengan 100 g MgCO3, kocok sampai larutan menjadi jernih, jika MgCO3 tidak larut seluruhnya disaring. Tepat-kan pH larutan menjadi 7 (biasanya pH larutan formal-dehid yang sudah ditambah-kan MgCO3 ini lebih besar dari 7 sehinga perlu ditam-bahkan formaldehid secukup-nya sampai pH menjadi 7). 6. Indikator merah fenol. Campurkan 0.1 g merah fenol dengan 2.84 ml NaOH 0.1M kemudian encerkan menjadi 100 ml dengan menambah-kan air. Peralatan yang digunakan 1. Alat distilasi Kjeldahl atau se-jenisnya 2. Waring blender 3. Sentrifuse 4. Buret dan statip. Cara kerja 1. Timbang 100 g sampel yang sudah digiling, masukkan ke dalam waring blender. 2. Tambahkan 300 ml larutan TCA 5%. Jalankan waring blender sampai sampel ho-mogen. 3. Pisahkan ekstrak TCA de-ngan cara penyaringan atau sentrifus. 4. Ambil 5 ml ekstrak TCA masukkan ke dalam alat distilasi Kjeldahl semimikro. Tambahkan 5 ml NaOH 2 M. 5. lakukan distilasi dimana dis-tilat ditangkap dengan 15 ml HCl 0.01 M standar. 6. Tambahkan beberapa tetes merah fenol ke dalam destilat, lalu titrasi dengan NaOH 0.01 M standar sampai tercapai titik akhir. 7. Tambahkan 1 ml formaldehid 16% untuk setiap 10 ml cam-puran sesudah titrasi yang pertama, kocok, kemudian Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 359titrasi lagi dengan NaOH 0.01 M standar. Perhitungan : 14(300+W)(15-V1)(0.01) 100 TVB = ----------------------------- x ------- 5 M Dimana : 14 = bobot atom nitrogen V1= Volume NaOH 0.01 M yang dibutuhkan untuk titrasi 1 M = berat sampel (g) W = jumlah air yang adal dalam bahan (g) V2= Volume NaOH 0.01 M yang dibutuhkan untuk titrasi 2 16.2.3.2 Penetapan Trimetil Amin Untuk menetapkan TMA, keda-lam destilat yang sudah dititrasi dengan NaOH ditambahkan for-maldehid 16% sehingga seluruh komponennya yang mengandung gugus NH2 terikat oleh formal-dehid, TMA sendiri tidak terikat. Dengan mentitrasi kembali cam-puran yang sudah ditambah for-maldehid ini maka kadar TMA da-pat diketahui. Pereaksi yang digunakan dalam penetapan TMA sama dengan pereaksi untuk menetapkan TVB, yaitu adalah sebagai berikut : 1. Larutan TCA 5% (w/v) 2. NaOH 2 M 3. HCl 0.01 M 4. NaOH 0.01 M 5. Formadehid 15 % (w/v) netral. Encerkan 432.4 ml formal-dehid 37 % menjadi 1 liter dengan air. Campurkan 1 L formaldehid yang sudah dien-cerkan dengan 100 g MgCO3, kocok sampai larutan menjadi jernih, jika MgCO3 tidak larut seluruhnya disaring. Tepat-kan pH larutan menjadi 7 (bia-sanya pH larutan formaldehid yang sudah ditambahkan MgCO3 ini lebih besar dari 7 sehinga perlu ditambahkan formaldehid secukupnya sam-pai pH menjadi 7). 6. Indikator merah fenol. Campurkan 0.1 g merah fenol dengan 2.84 ml NaOH 0.1M kemudian encerkan menjadi 100 ml dengan menambah-kan air. Peralatan yang digunakan untuk menentukan kadar TMA adalah : 1. Alat distilasi Kjeldahl atau se-jenisnya 2. Waring blender 3. Sentrifuse 4. Buret dan statip. Cara kerja 1. Timbang 100 g sampel yang sudah digiling, masukkan ke dalam waring blender. 2. Tambahkan 300 ml larutan TCA 5%. Jalankan waring blender sampai sampel ho-mogen. 3. Pisahkan ekstrak TCA de-ngan cara penyaringan atau sentrifus. Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 3604. Ambil 5 ml ekstrak TCA ma-sukkan ke dalam alat distilasi Kjeldahl semikikro. Tambah-kan 5 ml NaOH 2 M. 5. lakukan distilasi dimana dis-tilat ditangkap dengan 15 ml HCl 0.01 M standar. 6. Tambahkan beberapa tetes merah fenol ke dalam destilat, lalu titrasi dengan NaOH 0.01 M standar sampai tercapai ti-tik akhir. 7. Tambahkan 1 ml formaldehid 16% untuk setiap 10 ml cam-puran sesudah titrasi yang pertama, kocok, kemudian titrasi lagi dengan NaOH 0.01 M standar. Perhitungan : 14(300+W)V2)(0.01) 100 TMA = ------------------------- x ------- 5 M Dimana : V1= Volume NaOH 0.01 M yang dibutuhkan untuk titrasi 1 M = berat sampel (g) W = jumlah air yang adal dalam bahan (g) V2= Volume NaOH 0.01 M yang dibutuhkan untuk titrasi 2 16.3. Analisis lemak 16.3.1 Penetapan lemak kasar 16.3.1.1 Metode Ekstraksi Soxhlet Pereaksi yang digunakan : 1. Pasir 2. Petroleum eter Peralatan yang digunakan : 1. Tabung ekstraksi Soxhlet 2. Thimble 3. Botol timbang 4. Penangas air 5. Oven 6. Timbangan Gambar 16.1 Tabung ekstraksi Soxhlet Cara Kerja 1. Timbang 2 g sampel yang telah dihaluskan (sebaiknya yang kering dan lewat 40 mesh), campurkan dengan pasir yang telah dipijarkan sebanyak 8 g dan masukkan ke dalam tabung ekstraksi Soxhlet dalam Thimble. 2. Alirkan air pendingin melalui kondensor 3. Pasang tabung ekstraksi pada alat distilasi Soxhlet dengan pelarut petroleum eter secukupnya selama 4 jam. Setelah residu dalam tabung ekstraksi diaduk, ekstraksi dilanjutkan lagi selama 2 jam dengan pelarut yang sama. 4. Petroleum yang mengandung ekstrak lemak dan minyak dipindahkan ke dalam botol timbang yang bersih dan Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 361diketahui bobotnya, kemudian uapkan dengan penangas air sampai pekat. Teruskan pe-ngeringan dalam oven 100oC sampai bobotnya konstan. Berat residu dalam botol timbang dinyatakan sebagai berat lemak dan minyak. 16.3.1.2 Metode modifikasi Babcock Metode ini digunakan untuk penetapan kadar lemak secara cepat bahan-bahan ikan segar, ikan olahan (atau sejenisnya) dan cocok sebagai ’screenign test. Prinsip metode modifikasi Bab-cock adalah mengukur kadar le-mak yang terpisah dari aqueous karena diekstrak dengan meng-gunakan asam sulfat panas. Pereaksi yang digunakan : 1. Asam sulfat 92%, BJ 1.825 2. Zephiran Peralatan yang digunakan : 1. Timbangan analitik 2. Botol Babcock untuk skim (atau krim untuk sampel ber-kadar lemak tinggi) kapasitas 9 gram. 3. Heated Babcock sentrifus atau penangas air Cara Kerja 1. Timbang 9 ± 0.1g sampel dalam gelas piala 50 ml. 2. Tambahkan 10 ml air hangat dan campur merata dengan menggunakan gelas penga-duk. Untuk fish ball dan produk-produk emulsi yang mengandung pati, tambahkan 1 ml Zephira. 3. Untuk produk-produk daging utuh, tambahkan dengan hati-hati 20 ml asam sulfat 92%. Untuk fish ball dan produk olahan ikan lainnya tambah-kan 12 ml asam sulfat 92%. Sebentar-sebentar campuran digoyang-goyang sampai se-luruh bahan tercerna sempur-na (terdigest sempurna) sela-ma 10 menit. Jika dalam 10 menit belum seluruhnya ter-cerna maka perlu ditambah lagi asam sulfat sebanyak 5 ml. 4. Pindahkan isi gelas piala secara kuantitatif ke dalam botol babcock dengan cara menuangnya lalu cucilah re-sidu yang ada dalam gelas piala dengan air panas (80oC) sebanyak dua kali masing-masing 10 ml. 5. tambahkan akuades sehingga permukaan larutan berada 10 cm di bawah batas skala teratas. 6. Sentrifus botol dalam ’heated babcock centrifuge’ selama 3 menit. Alternatif lain, biarkan botol dalam penangas air 70oC, permukaan air pada penangas di atas batas kolom lemak. Biarkan dalam pena-ngas selama 10 menit. 7. Ukur panjang kelompok le-mak di dalam botol sesuai dengan skala yang ada, pan-jang ini menyatakan persen kadar lemak dalam sampel. Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 362 Catatan : Kolom lemak seharusnya ber-warna kuning terang. Jika ada lapisan ’fluffi’ (seperti benang rambut halus), ulangi penetapan sekali lagi, pada ulangan perha-tikan baik-baik kesempurnaan pencernaan (digest). Jika kolom lemak gelap, gunakan asam sul-fat yang lebih sedikit pada waktu pencernaan. 16.3.1.3 Metode Babcock Metode babcock digunakan untuk menentukan kadar lemak susu. Prinsip kerjanya adalah meng-hancurkan emulsi lemak susu de-ngan menggunakan H2SO4. De-ngan menggunakan sentrifus atau pemanasan, lemak dalam susu dapat dipisahkan sehingga dapat diukur kadarnya pada botol yang telah dikalibrasi (botol bab-cock). Peraksi dan peralatan yang digunakan : 1. H2SO4 pekat, BJ 1.80 – 1.84 2. Botol Babcock standar, skala 0 – 8%, kapasitas 18 g. 3. Sentrifus yang dilengkapi pemanas. 4. Penangas air. 5. Pipet volumetrik 17.6 ml Gambar 16.2. Botol Babcock Cara Kerja 1. Pipet 17.6 ml susu bersuhu 22oC, masukkan kedalam bo-tol babcook. 2. Tambahkan 17.5 ml H2SO4 pekat bersuhu 22oC. 3. Kocok dengan cara rotasi sampai seluruh susu larut, seluruh curd’ hilang. 4. Tempatkan botol Babcock ke dalam sentrifus bersuhu 60oC, lakukan sentrifus pada 700-100 rpm selama 5 menit. 5. Tambahkan air panas (60oC) ke dalam botol Babcock sampai batas skala terbawah. Sentrifus lagi selama 2 menit pada suhu 60oC. Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 3636. Tambahkan lagi air panas (60oC) ke dalam botol sampai sedikit di bawah batas skala teratas. Sentrifus lagi selama 1 menit pada suhu 60 oC. 7. Tempatkan botol Babcock da-lam penangas air 55- 60oC sampai batas skala teratas berada di bawah permukaan. Biarkan selama 5 menit. 8. Jika perlu dapat digunakan bantuan lampu penerangan yang memancarkan cahaya hijau lembut. Catatan Pada waktu pengukuran, kolom lemak seharusnya translusen, berwarna kuning keemasan atau amber, dan bebas dari partikel suspensi. Jika tidak suka, pene-tapan harus diulangi dengan me-nyesuaikan jumlah H2SO4 yang ditambahkan. 16.3.1.4 Metode Gerber Metode Gerber digunakan untuk penentuan kadar lemak susu. Prinsipnya, susu dicampur de-ngan H2SO4 dan amil alkohol dalam tabung Gerber khusus lalu disentrifus sehingga lemak susu terpisah dan menempati bagian atas tabung. Lemak yang ter-pisah ini dapat ditentukan kadarnya dengan melihat pan-jang kolom lemak yang terbentuk. Pereaksi yang digunakan : 1. Asam sulfat 90% (w/w), BJ 1.815 2. Amil alkohol Peralatan yang digunakan : 1. Tabung butirometer Gerber 2. Sentrifus Gerber berdiameter 50 cm. 3. Pipet volumetrik 10.75 ml Gambar 16.3.Tabung butirometer Gerber Cara kerja 1. Masukkan 10 ml H2SO4 ke dalam tabung butirometer de-ngan tanpa membasahi leher tabung 2. Pipet 10.75 ml susu, ma-sukkan ke dalam tabung bu-tirometer dengan tanpa mem-basahi leher tabung 3. Tambahkan 1 ml amil alkohol. Tutup tabung dengan penu-tupnya, kocok merata, sentri-fus selama 4 menit pada 1100 rpm. 4. Tempatkan tabung dalam pe-nangas air 65oC selama 3 menit Analisis Nutrisi Pengawasan Mutu Bahan / Produk Pangan 3645. Baca persentase kadar lemak (w/w), sesuai dengan panjang kolom tabung yang telah dikalibrasi. Catatan : 1. Jumlah sampel yang diam-bil untuk analisis ini ber-beda-beda untuk setiap negara, sebagai contoh : India Belanda Hongaria Inggris Amerika 10.75 ml 10.66 ml 10.80 ml 10.94 ml 11.00 ml 2. Jangan tambahkan amil alkohol sedemikian rupa sehingga kontak langsung dengan asam 3. Persiapkan kain dan so-dium bikarbonat. Kedua bahan ini berguna jika tabung butirometer yang berisi H2SO4 pekat pecah. 16.3.1.5 Metode Rose-Gottlieb Metode Rose-Gottlieb digunakan untuk menentukan kadar lemak susu, produk susu, dan es krim. Keakuratan metode ini lebih baik dibandingkan metode Babcock atau Gerber. Prinsip dari metode ini adalah adalah mengekstrak sampel le-mak menggunakan dietil eter dan protoleum eter. Sampel lemak di-netralkan dahulu dengan amonia dan dicampur dengan alkohol. Pereaksi yang digunakan 1. Larutan amonia 35% (w/v, BJ 0.88) dan 26% (w/v, BJ 0.908) (lihat catatan 1). 2. Etanol 95-96% (v/v). 3. Dietil eter, bebas peroksida, titik didih 34-35oC. 4. Petroleum eter, titik didih 40-60oC. 5. Eter campuran. Campurkan dalam volume yang sama dietileter dengan petroleum eter. Peralatan yang digunakan : 1. Oven, lebih disukai yang dilengkapi dengan fan. 2. Tabung ekstraksi Mojonnier dengan penutup. 3. Sentrifus, dapat digunakan sentrifus Mojonnier. 4. Labu berdasar rata, berleher pendek, kapasitas 160 ml, berat 40 – 50 g. 5. Penangas air Cara Kerja 1. Timbang 4-5 g sampel dalam tabung ekstraksi (lihat catatan 2). 2. Tambahkan 1.5 ml amonia 35% (v/v), campur merata (lihat catatan 1). 3. Tambahkan 7 ml air hangat dan campur merata lagi (lihat catatan 3). 4. Panaskan sampai 60-70oC dan pertahankan pada suhu ini selama 15 menit. 5. Tambahkan 10 ml etanol, kocok, biarkan dingin (lihat catatan 4). Next >